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혈청 샘플의 기능 분석을 위해 이전에 설명한 대로 비드 기반 분석을 사용하여 항체 의존성 세포 식세포 작용, 항체 의존성 호중구 식세포 작용 및 항체 의존성 보체 침착을 정량화했습니다. 형광 스트렙타비딘 비드를 비오틴화된 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체에 커플링하고 희석된 혈청과 함께 인큐베이션했습니다. ADCP의 경우, 인간 단핵구 세포주에서 유래한 THP-1 세포를 면역 복합체에 첨가하고 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. ADNP의 경우 전혈에서 염화암모늄 칼륨 용해 완충액을 사용하여 1차 호중구를 분리했습니다. 37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 호중구를 항-CD66b PacBlue 검출 항체로 염색했습니다. ADCD 분석의 경우, 동결건조된 기니피그 보체 성분 3b를 제조업체의 지침에 따라 재현탁하고 칼슘 및 마그네슘이 포함된 젤라틴 베로날 완충액에 희석했습니다. 인큐베이션 후, C3는 기니피그 보체 C3에 대한 플루오레세인-접합 염소 IgG 분획으로 검출되었습니다. ADCP의 경우 이벤트는 비드 양성 세포에서 게이팅된 반면 호중구는 CD66b 양성으로 정의된 후 ADNP에 대한 비드 양성 호중구에서 게이팅되었습니다. ADCP 및 ADNP 데이터는 다음 공식을 사용하여 계산된 식세포 점수로 보고되었습니다. 식세포 점수 = {[비드-양성 세포의 백분율] × [비드-양성 세포에 대한 기하학적 평균 MFI, 평균 형광 지수]}/1000.
ELISPOT 분석 플레이트를 웰당 1μg의 마우스 항-인간 IFN-γ 모노클로날 항체로 코팅하고 4°C에서 밤새 인큐베이션했습니다. 플레이트를 DPBS로 세척하고 R10 배지 : 100X 페니실린-스트렙토마이신 1%, HEPES 완충액 1M, 피루브산나트륨 100mM, 200mM L을 포함하는 10% 열-불활성화 소태아혈청를 포함하는 RPMI로 차단했습니다. -글루타민, 및 0.1%의 55mM의 2-머캅토에탄올을 37℃에서 2 내지 4시간 동안. 야생형, B.1.1.7 및 B.1.351 변이체 스파이크로부터의 펩티드를 제조하고 웰당 2㎍의 농도로 플레이팅하고, 웰당 100,000개 세포를 플레이트에 첨가하였다. 펩티드 및 세포를 37℃에서 15 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 이후의 모든 단계는 실온에서 수행되었습니다. 플레이트를 ELISPOT 세척 완충액으로 세척하고 1㎍/mL의 비오틴화된 마우스 항-인간 IFN-γ 모노클로날 항체와 함께 2 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고 1.33㎍/mL의 접합된 염소 항비오틴 알칼리성 포스파타제와 함께 2 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후 nitor-blue 테트라졸륨 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌리포스페이트 p- 톨루딘 염 기질 용액을 7분 동안 첨가하였다. 발색체를 버리고 플레이트를 물로 세척하고 어두운 곳에서 24시간 동안 건조시켰다. 플레이트를 스캔하고 면역점 분석기에서 계수했습니다. 말초 혈액 단핵 세포 를 CD49d 단클론 항체 및 CD28 단클론 항체가 보충된 100μL의 R10 배지에 106세포 의 농도로 재현탁시켰다 . 각 샘플은 모의 펩타이드 및/또는 10pg/mL의 포르볼 미리스테이트 아세테이트 및 1μg/mL의 이오노마이신을 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 배양 후 R10 50μL에 모넨신이 포함된 GolgiStop 0.25μL와 브레펠딘 A가 포함된 GolgiPlug 0.25μL를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 8시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 4°C에서 밤새 유지했습니다.
다음날, 세포를 DPBS로 2회 세척하고 아쿠아 생사 염료로 10분 동안 염색한 후 CD279, CD4, CD27, CD8 및 CD45RA에서 30분 동안. 그런 다음 세포를 2% FBS-DPBS 완충액으로 2회 세척하고 200μL의 BD CytoFix/CytoPerm 고정/투과성 용액과 함께 15분 동안 인큐베이션했습니다. 세포를 1x Perm 세척 완충액MilliQ 물로 희석하고 0.22μm 필터를 통과한 CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization 키트의 BD Biosciences Perm/Wash Buffer 10x으로 2회 세척하고 Ki67에 대한 mAb로 세포내 염색했습니다. , BB515, IL-21, CD69, IL-10, IL-13, IL-4, TNF, IL-17, IFN-γ, IL-2, IL-6 및 CD3 클론 SP34.2, Alexa 700)에서 30분 동안. 세포를 1X Perm Wash 완충액으로 두 번 세척하고 새로 제조된 1.5% 포름알데히드 250μL로 고정했습니다. 고정된 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮기고 BD FACSymphony 시스템으로 분석했습니다.
기술 통계는 SAS 9.4 및 GraphPad Prism 8.4.3을 사용하여 계산되었습니다. 데이터는 사분위수 범위가 있는 중앙값 또는 표준 편차(SD)가 있는 비율로 표시됩니다.
그렇게 병원 전체의 생물 리포지토리에는 mRNA COVID-19 백신을 접종하고 분석에 사용할 수 있는 혈청을 보유한 18세에서 45세 사이의 여성 103명이 등록했습니다. 추가로 4명이 참여를 거부했고 이 103명의 참가자 중 30명이 임신했습니다. 16명은 수유 중이었습니다. 57명은 임신도 수유도 하지 않았습니다. 샘플은 임신하지 않은 여성의 경우 2차 백신 접종 후 21일, 임산부의 경우 21일, 그리고 26일의 중앙값을 얻었습니다. 수유중인 여성으로부터. 연구 기간 동안 9명의 임산부가 출산하여 유아 제대혈을 기증했습니다. 56명의 참가자 54%가 BNT162b2를 받았습니다. 47명46%는 mRNA-1273을 받았습니다. 이전에 SARS-CoV-2 감염은 예방접종을 받은 참가자의 4명 4%에서 진단되었습니다. 임신한 참가자 중 5명 17%은 첫 번째 삼 분기에 첫 번째 백신 접종을 받았고, 15명 50%는 두 번째 삼 분기에, 10명 33%는 세 번째 삼 분기에 접종을 받았습니다. 병원 전체의 생물 리포지토리에는 60명의 임산부를 포함하여 SARS-CoV-2 검사를 받은 18세에서 45세 사이의 여성 70명이 등록했습니다. 추가로 76명이 참여를 거부했습니다. 여기에 제시된 분석에는 SARS-CoV-2 감염이 있는 22명의 임산부와 6명의 비임신 백신 접종하지 않은 여성이 포함되며, 분석에 사용할 수 있는 혈청이 있었습니다. 이 참가자들은 백신을 접종한 여성보다 흑인 또는 히스패닉으로 스스로를 식별할 가능성이 더 높았습니다. 백신을 접종하지 않았지만 감염된 여성의 경우, 증상 발현 또는 무증상인 사람들은 중합효소연쇄반응 검사 결과 양성부터 검체 채취까지의 중앙값은 12일 IQR, 10-20일이었습니다. 임신하지 않은 여성 및 임산부의 경우 41일 IQR, 15-140일. 감염되었지만 백신을 접종하지 않은 참가자 중 1명의 비임신 17%와 3명의 임산부 14%가 심각한 질병을 경험했습니다.